Laws of Vietnam

QUYẾT ĐỊNH CỦA BỘ TRƯỞNG

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

Ban hành tiêu chuẩn ngành về: Phương pháp

bảo quản dài hạn nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp bằngnitơ lỏng (4162000)

BỘ TRƯỞNG BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

Căn cứ Nghị định số 73/CP ngày 01 tháng 11 năm 1995 của Chính phủquy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và tổ chức bộ máy của Bộ Nông nghiệp vàPhát triển Nông thôn;

Căn cứ Nghị định 86/CP ngày 08 tháng 12 năm 1995 của Chính phủ quyđịnh phân công trách nhiệm quản lý Nhà nước về chất lượng hàng hoá;

Xét đề nghị của ông Vụ trưởng Vụ Khoa học Công nghệ và Chất lượngsản phẩm;

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1:Nay ban hành tiêu chuẩn ngành sau:

10TCN:4162000 Phương pháp bảo quản dài hạn nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp bằng nitơ lỏng gồm 3 mục 13 điểm

Điều 2:Quyết định có hiệu lực sau 15 ngày kể từ ngày ký

Điều 3:Các ông Chánh Văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Công nghệ và Chất lượng sảnphẩm, các tổ chức, cá nhân có liên quan chịu trách nhiệm thi hành quyết địnhnày.

PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN DÀI HẠN NGUỒN GEN VI SINH VẬT

NÔNG NGHIỆP BẰNG NI TƠ LỎNG

YÊU CẦU KỸ THUẬT

 Ban hành kèm theo quyết định số: 54/2000/QĐBNN/KHCN ngày15/ 05/ 2000 

TIÊU CHUẨN PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN DÀI HẠN NGUỒN GEN

VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP BẰNGNITƠ LỎNG 10TCN 4162000

 Ban hành kèm theo quyết định số: 54/2000/QĐBNN/KHCN ngày15/ 05/ 2000

1/ Phạm vi áp dụng:

Tiêuchuẩn này áp dụng cho việc bảo quản dài hạn vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí và vihiếu khí sử dụng trong nông nghiệp (trừ vi sinh vật trong lĩnh vực thú y) dướidạng là tế bào sinh dưỡng và bào tử trong điều kiện vô trùng bằng phương phápnitơ lỏng.

2/ Thuật ngữ, định nghĩa:

2.1.Vi sinh vật nông nghiệp: Là các loại vi sinh vật khác nhau thuộc vi khuẩn, xạkhuẩn, vi khuẩn lam, nấm men, nấm mốc đang là đối tượng được nghiên cứu và sửdụng trong nông nghiệp, được Bộ nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép.

2.2.Bảo quản vi sinh vật: Là bảo quản các mẫu giống thuần khiết sau khi đã chọnlọc, trong điều kiện phù hợp để bảo đảm độ sống sót cao và bảo tồn các tínhtrạng ban đầu.

2.3.Bảo quản dài hạn: Là bảo quản các mẫu giống trong thời gian trên 2 năm.

2.4.Đặc tính sinh học: Là khả năng của vi sinh vật thông qua hoạt động sống củachúng có tác dụng đến quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng,vật nuôi,kiểm soát sinh học và sinh thái môi trường.

2.5.Môi trường nuôi cấy chọn lọc: Là môi trường chỉ phù hợp cho sự sinh trưởng,phát triển của một loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó.

2.6.Môi trường chẩn đoán phân biệt (môi trường chỉ thị): Là môi trường cho phépphân biệt nhanh chóng một loại vi sinh vật này với các loại vi sinh vật khác.

2.7.Mẫu giống: Là giống do tác giả thu thập, chọn lọc, lai tạo hay lấy từ quĩ gencó tính di truyền ổn định.

2.8.Thời gian cấy chuyển: Là khoảng thời gian giữa 2 lần cấy để duy trì các tínhtrạng của vi sinh vật.

2.9.Độ phần trăm sống sót của mẫu giống: Là tỷ lệ phần trăm của số lượng tế bàosống sót trong các mẫu giống bảo quản so với mẫu giống gốc khi mới được nuôicấy và phát triển ổn định.

2.10.Hồi phục giống: Là quá trình cấy chuyển vi sinh vật từ mẫu bảo quản vào môi trườngdinh dưỡng thích hợp để vi sinh vật khôi phục lại các tính trạng ban đầu.

3. Nội dung:

3.1. Trang thiết bị:

Tủsấy (thiết bị tiệt trùng khô) và nồi hấp áp lực (thiết bị tiệt trùng ướt)

Tủấm

Tủcấy vô trùng

Tủlạnh sâu

Bìnhđể mẫu vi sinh vật có chứa nitơ lỏng

Bìnhtrữ nitơ lỏng

Găngtay (Poleyolefin)

Ống nghiệm polypropylen có nútxoáy, dung tích 2ml, chịu nhiệt độ thấp, khử trùng được hoặc ampul thuỷ tinhtrung tính

Cânkỹ thuật có độ chính xác tới 0,01g

Quecấy

Quegạt thủy tinh

Ống nghiệm thủy tinh

Ống đong

Bìnhtam giác

Đĩapetri (hộp lồng)

Pipetchia độ, pipetman

Đèncồn hoặc đèn gas

3.2. Tiến hành:

3.2.1. Chuẩn bị dụng cụ:

Cácdụng cụ dùng trong xác định vi sinh vật phải tiệt trùng bằng một trong các phươngpháp dưới đây:

Trongtủ sấy ở nhiệt độ 160 175⁰C không ít hơn 2 giờ.

Trongnồi hấp áp lực 1atmotphe (121⁰C) không ít hơn 20 phút.

Chuẩnbị ống nghiệm polypropylen (hoặc ampul): ngâm trong dung dịch HCl 2% trong 12giờ. Sau đó rửa lại bằng nước máy 3 4 lần và tráng lại bằng nước cất rồi khửtrùng trong nồi hấp áp lực 1atmotphe (121⁰C) không ít hơn 20 phút.

3.2.2. Chuẩn bị môi trường:

Môitrường nuôi cấy sinh khối và kiểm tra độ phần trăm sống sót của mẫu giống làmôi trường nuôi cấy chọn lọc (mục 2.5).

Cânvà hoà tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho. Phânphối môi trường vào các bình tam giác. Đậy nút bông, khử trùng ở điều kiện phùhợp cho từng loại môi trường.

Môitrường bảo vệ: có tỷ lệ sữa tách bơ 10% (w/v), hoặc glyxerol 10% (v/v), hoặcDimetyl sunfoxide (DMSO) 5% (v/v). Môi trường bảo vệ cần được tiệt trùng bằngphương pháp Pasteur, hoặc màng lọc vi khuẩn hoặc ở 121⁰C trong 15phút.

3.2.3. Chuẩn bị mẫu giốn:

Mộtmẫu giống vật liệu cần giữ một lượng mẫu lặp lại không ít hơn ba lần.

Khôngđược chọn những khuẩn lạc riêng biệt trong các lần cấy chuyển làm giống (tránhđột biến sinh trưởng).

Việclấy mẫu được tiến hành sao cho mẫu kiểm tra phải là mẫu thuần. Người lấy mẫuphải được huấn luyện và có kinh nghiệm trong việc lấy mẫu.

Trongquá trình lấy mẫu, vận chuyển và xử lý mẫu phải đảm bảo tránh sự tạp nhiễm từbên ngoài và đảm bảo được tính nguyên trạng ban đầu.

3.2.4. Chuẩn bị dịch huyền phù: theo 2 cách

3.2.4.1.Chuẩn bị dịch huyền phù từ mẫu giống nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng:

Cácmẫu giống được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng thích hợp. Sau khi tế bàophát triển tốt, ổn định (pha sinh trưởng), thu sinh khối vi sinh vật để tiếnhành bảo quản.

Dùngpipet vô trùng hút 5ml môi trường dinh dưỡng (NB) chứa 10% (v/v) glycerol hoặc5% (v/v) DMSO hoặc 10% (w/v) sữa tách bơ vào mỗi ống thạch nghiêng.

Dùngpipet vô trùng hút 5ml môi trường dinh dưỡng (NB) chứa 10% (v/v) glycerol hoặc5% (v/v) DMSO hoặc 10% (w/v) sữa tách bơ vào mỗi ống thạch nghiêng.

Dùngdụng cụ vô trùng đánh tan toàn bộ sinh khối trên bề mặt thạch nghiêng vào môitrường, sau đó hút toàn bộ dịch huyền phù tế bào, đảm bảo mật độ tế bào ít nhấtlà 10⁸ tế bào/ml.

Dùngpipet vô trùng phân 1ml của dịch huyền phù tế bào vào ống nghiệm polypropylen,vặn chặt nút . Có thể sử dụng ampul thuỷ tinh, gắn đầu ampul bằng đèn khò.Không để rây dịch vi sinh lên mép hoặc thành ống nghiệm polypropylen hoặcampul.

Đặtampul trong tủ lạnh 5⁰C trong 30 phút để đạt được sự ổn định giữa tếbào và môi trường.

3.2.4.2.Chuẩn bị dịch huyền phù từ mẫu giống nuôi cấy trên môi trường dịch thể:

Cácmẫu giống được nuôi cấy trên môi trường dịch thể thích hợp. Sau khi tế bào pháttriển tốt, ổn định, tiến hành bảo quản bằng nitơ lỏng.

Dùngpipet vô trùng bổ sung một lượng 20% (v/v) glycerol hoặc 10% (v/v) DMSO hoặc20% sữa tách bơ đã khử trùng bằng thể tích của dịch vi sinh vật để đạt nồng độglycerol cuối cùng 10% (v/v) hoặc DMSO 5% (v/v) hoặc sữa tách bơ 10% (w/v).                  

Lắcnhẹ để thu được dịch huyền phù tế bào đồng đều, đảm bảo mật độ tế bào ít nhấtlà 10⁸ tế bào/ml. Nếu giống vi sinh vật mọc thành viên nhỏ hay thànhđám lớn, có thể dùng máy nghiền mô nhỏ hoặc cối sứ vô trùng để nghiền nát.

Dùngpipet vô trùng phân 1ml của dịch huyền phù tế bào vào ống nghiệm polypropylen,vặn chặt nút. Có thể sử dụng ampul thuỷ tinh, gắn đầu ampul bằng đèn khò. Khôngđể rây dịch vi sinh lên mép hoặc thành ống nghiệm polypropylen hoặc ampul.

Đặtampul trong tủ lạnh 5⁰C trong 30 phút để đạt được sự ổn định giữa tếbào và môi trường.

3.2.5. Quá trình bảo quản bằng nitơ lỏng: được tiến hành như sau:

Đặtống nghiệm polypropylen (ampul) vào trong khay nhôm. Sau đó đặt vào buồng làmlạnh của máy làm lạnh.

Điềuchỉnh tốc độ làm lạnh 12⁰C/phút đến khi nhiệt độ đạt âm 30⁰C.Sau đó tiếp tục điều chỉnh tốc độ làm lạnh 1⁰C/phút đến khi nhiệt độđạt không nhỏ hơn âm 50⁰

Nhanhchóng chuyển ống nghiệm polypropylen (ampul) đến vị trí bảo quản cuối cùngtrong bình nitơ lỏng (nhiệt độ từ âm156⁰C đến âm 196⁰C).

Ghi chú: Cần đi găng tay poleyolefin khi thao tác để tránh bị bỏngtay.

3.3. Kiểm tra giống:

Địnhkỳ hàng năm kiểm tra độ sống sót và đặc tính sinh học của giống. Chỉcho phép giữ lại các giống có độ sống sót và có hoạt tính sinh học ổn định nhưgiống gốc.

3.3.1. Kiểm tra độ sống sót của giống:

3.3.1.1.Môi trường để kiểm tra:

Dùngmôi trường nuôi cấy chọn lọc là môi trường để kiểm tra. Môi trường được pha chếtheo thứ tự các hoá chất trong thành phần đã cho. Sau đó phân phối vào các dụngcụ thuỷ tinh đã chuẩn bị trước rồi khử trùng ở những điều kiện phù hợp. Đểnguội môi trường đến 4550⁰C rồi phân phối vào các đĩa petri vôtrùng. Thao tác này được thực hiện trong điều kiện vô trùng.

3.3.1.2.Dịch pha loãng: Nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), không chứa các hợp chất nitơ,sau khi khử trùng có độ pH là 7,0.

Phânphối dịch pha loãng vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp với một lượng saocho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9ml. Làm nút bông và khử trùng ở 1atmotphe (121⁰C) trong 30 phút.

Nếuchưa sử dụng ngay, dịch pha loãng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ410⁰C, thời gian bảo quản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị.

Ghi chú: Để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đổinhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh nhiệt độ của dịch pha loãng đến nhiệt độphòng thử nghiệm trước khi sử dụng.

3.3.1.3.Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào (suspension):

Lấyống giống bảo quản cần kiểm tra ra khỏi bình nitơ lỏng, cho băng tan tự nhiên(trong điều kiện phòng thử nghiệm).

Laubên ngoài của ống nghiệm polypropylen (ampul) bằng gạc vô trùng có thấm etanol70% (v/v), đặc biệt chú ý đến vùng giữa nút và thân ống.

Mởnút ống nghiệm polypropylen (ampul) trong điều kiện vô trùng. Dùng bơm tiêm đãvô trùng hút 1ml dịch huyền phù trong ống nghiệm cho vào 9 ml dịch pha loãng,tránh chạm bơm tiêm vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vôtrùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 510 giây.Lặp lại các thao tác này để thu được dịch pha loãng 10³, 10⁴,10⁵, 10⁶, 10⁷.

Cấymẫu: dùng pipet vô trùng lấy từ dịch mẫu pha loãng một lượng 0,05 ml mẫu (1giọt) cấy vào 1 đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (xem 3.3.1). Mỗi mẫupha loãng được cấy vào 3 đĩa petri (mỗi độ pha loãng sử dụng 1 pipet vô trùngriêng).

Dùngque gạt vô trùng gạt đều dịch mẫu trên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úpngược đĩa petri, để trong tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp.

Đếmsố lượng khuẩn lạc đặc trưng của mẫu giống vi sinh vật trên mỗi đĩa petri.

Mậtđộ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra (ml) được tính theo công thức sau:

Trongđó: d = a x 20A

A:số khuẩn lạc/ml dịch

a:số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa petri

d:nồng độ dịch pha loãng

20:số giọt dịch trong 1 ml dịch

Ghi chú: Số lượng khuẩn lạc trung bình được tính là trung bình cộngsố khuẩn lạc của các đĩa petri được câý từ cùng một độ pha loãng, trong đó chỉtính các đĩa petri chứa từ 30300 khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạc trung bình cũngcó thể được tính là trung bình cộng số lượng khuẩn lạc của các đĩa petri đượccấy từ hai độ pha loãng kế tiếp nhau bằng cách tính số khuẩn lạc trung bìnhcộng ở mỗi độ pha loãng, trong đó số khuẩn lạc ở độ pha loãng cao hơn được nhânvới 10, sau đó lấy trung bình cộng của hai giá trị trên nếu tỷ số giữa giá trịlớn và giá trị nhỏ không lớn hơn 2. Nếu tỷ số này lớn hơn 2 thì lấy giá trị nhỏlàm kết quả. Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra được biểu thị bằng mộtsố giữa 1,00 và 9,99 nhân với 10ⁿ, n là số mũ thích hợp.

Mậtđộ tế bào mẫu giống bảo quản

            % sống sót = x 100

Mậtđộ tế bào mẫu giống gốc

3.3.2. Xác định đặc tính sinh học:

Tiếnhành theo những phương pháp cụ thể phụ thuộc vào đặc tính sinh học của từngchủng vi sinh vật./.